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细菌鞭毛蛋白可以作为疫苗佐剂，具有重要的应用价值。传统的纯化细菌鞭毛蛋白的方法多需要使用超速离心或者层析交换，步骤非常繁琐，使用不便，为此本公司开发了不需要超速离心和层析交换的细菌鞭毛蛋白快速纯化试剂盒。

• 只有洗涤和沉淀两步，简单快捷。
  
• 所得细菌鞭毛蛋白纯度高，完整性好。
  
• 回收效率高，一般能得到相当于总蛋白量6%的鞭毛蛋白。
  
• 可用于Escherichia coli，Salmonella typhimurium，Salmonella typhi，Citrobacter freundii等细菌。
  
• 本制品需要冷冻高速离心机。
  
• 本制品足够20次细菌鞭毛蛋白纯化，每次可以处理1L饱和菌液。
  
• 本制品只能用于科研。

• 实验前取将适量的10×细菌鞭毛蛋白洗涤液用自备的超纯水稀释10倍后得到1×细菌鞭毛蛋白洗涤液，放冰上待用。
  
• 收集1L过夜培养的细菌饱和培养液（OD600在0.6左右即可），5000×g室温离心10分钟后弃上清。
  
• 在细菌沉淀中加入200mL自备的PBS缓冲液（pH7.4），充分混匀得到细菌重悬液。
  
• 5000×g室温离心10分钟，小心弃除上清。
  
• 重复3～4步一次。
  
• 在细菌沉淀中加入50mL 1×细菌鞭毛蛋白洗涤液，充分混匀得到细菌重悬液。
  
• 将细菌悬浮液转移到100mL烧杯中（或100mL平底塑料平中）并放入磁力搅拌子（搅拌子大小应适中，需保证搅拌充分），再将100mL烧杯放到一个大烧杯（如2L烧杯）中间，周边入碎冰固定小烧杯，然后将装有小烧杯的大烧杯放在磁力搅拌器上搅拌30分钟。
  
• 取出搅拌子，将细菌重悬液转移到离心管中，10000×g离心20分钟，小心收集约50mL含有细菌鞭毛蛋白的上清液。
  
• 用pH试纸检测溶液的pH。如果pH跟鞭毛蛋白的等电点相差超过0.5，最好用1M NaOH或1M盐酸将其调到不超过0.5。细菌鞭毛蛋白的pH一般在4.5～5.5之间，具体多少根据物种不同而不同，可以根据其氨基酸序列在线计算或参考相关文献。
  
• 用NanoDrop或类似仪器测定上清液中的蛋白浓度，用于后续计算回收率。
  
• 将上清液转移到一个100mL干净烧杯中并放入磁力搅拌子，再将100mL烧杯放到一个大烧杯（如2L烧杯）中间，周边加入碎冰固定小烧杯，然后将装有小烧杯的大烧杯放在磁力搅拌器上缓慢搅拌。搅拌中加入细菌鞭毛蛋白纯化沉淀剂24.7g（用前最好用研钵磨成细粉在45分钟的时间内分批少量缓慢加入，每次加入5g左右，搅拌溶解后再加入下一批，避免一次全部加入使得沉淀剂浓度过高让鞭毛蛋白变性失活），待最后一批沉淀剂加入后继续搅拌30分钟。最后静置至少45分钟，期间细菌鞭毛蛋白将形成沉淀。
  
• 取出搅拌子，将溶液转移到干净离心管中，4℃下10000×g离心10分钟。
  
• 所得沉淀为细菌鞭毛蛋白，小心转移上清到新的离心管中（在确认得到鞭毛蛋白之前不要丢弃此溶液。通过测定其蛋白浓度，并跟第10步所得浓度比较，即可粗略估计出蛋白沉淀的质量）。
  
• 用一定体积pH7.4的PBS缓冲液溶解蛋白沉淀。
  
• 由于所得细菌鞭毛蛋白含盐，所以用户需要采用过柱除盐法或透析除盐法除盐。由于细菌鞭毛蛋白分子量在15～40 KDa，所以需要据此选择合适截留孔径的透析袋（3.5kDa或7kDa孔径），在合适透析液（根据后续实验确定，如无特殊需求可用PBS缓冲液，pH7.4）中进行过夜透析。本试剂盒不含相关试剂。